禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类高度接触性、急性传染病，禽流感病毒属于正黏病毒科流感病毒属 A 型禽流感病毒 [1] 。禽流感病毒有很多亚型，其中认为H5 和 H7 亚型多为高致病性强毒株 [2] 。2013 年 3 月，首先在华东地区发现了 3 例人感染 H7N9 流感病例 [3] ，随后向全国各地扩散，造成了人的死亡，给公共卫生造成了较大的威胁，对家禽养殖业形成了很大冲击。自从 H7N9 亚型流感发现以来，对家禽的临床症状主要表现为低致病性，但在 2017 年 1 月农业部门在活禽交易市场发现了具有高致病性分子特征 H7N9 亚型流感病毒，随后在全国各地有零星疫情发生 [4] 。H7N9 亚型流感病毒发生变异,从对家禽的低致病性变异为对家禽尤其是鸡的高致病性, 目前已报道发生的高致病性 H7N9 亚型流感疫情的家禽养殖场几乎都是鸡场。为了遏制 H7N9 亚型流感疫情，2017 年 7月开始，农业部率先在广东和广西两地开展重组禽流感（H5+H7）二价疫苗免疫试点，此次为 H7 亚型禽流感疫苗的初次免疫。为掌握鸡免疫重组禽流感（H5+H7）二价疫苗后，H7N9 亚型禽流感病毒抗体的消长规律，在东莞市选取了一个蛋鸡场进行临床试验，现将试验情况报告如下。
1、材料与方法
1.1 实验动物
在东莞市某蛋鸡场，随机选取 1 个批次 27只 181 天龄的蛋鸡进行试验，用脚环对每羽鸡做好标记直到试验结束，临床表现健康，分别在181d、202d 免疫重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗 0.5mL，为哈尔滨维科生物技术开发公司产品，批号 20180603。
1.2 样品采集
分别在蛋鸡的181d、188d、195d、202d、209d 和 256d，翅静脉采集全血，3 000 r/min 离心 10 min，分离出血清，-20℃保存，待检。
1.3 仪器设备
96 孔“V”型反应板，离心机，8 道移液器，微量震荡器等。
1.4 试剂
1.4.1 1%鸡红细胞悬液
采集实验室饲养的 3 只禽流感和新城疫非免疫的健康公鸡的血液与阿氏液等体积混合，用 pH 值 7.2 的 0.01 mol/L PBS 液洗涤 3 次，每次以 1 000 r/min 离心 10 min，洗涤后用 PBS 液配成体积分数 1%鸡红细胞悬液，4℃保存备用。
1.4.2 抗原和阳性血清
H7N9 亚型禽流感抗原（Re-1 株）和阳性血清，为中国哈尔滨维科生物科技有限公司产品，批号分别为：20170302,2016001。
1.5 方法
按照《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T18936-2003) 的血凝与血凝抑制方法操作。以完全抑制 4 单位抗原的血清最高稀释倍数作为 HI 的滴度。HI 效价小于或等于 31og2 判阴性，HI 效价大于或等于 41og2 判阳性,判定为抗体合格。
2、结果与分析
试验的结果为，鸡群在免疫疫苗前（181 日龄）H7N9 亚型禽流感抗体滴度中位数为0.74log 2 ，只有 1 份血清抗体阳性；在 188 日龄，抗体滴度中位数为3.30log2 ，抗体阳性率33.33%；在 195 日龄，抗体滴度中位数为7.74log2 ，抗体阳性率为 88.89%；在 202 日龄，抗体滴度中位数为 5.37log2 ，抗体阳性率为85.19%；在 209 日龄，抗体滴度中位数为8.52log2 ，抗体阳性率为 100%；在 256 日龄，抗体滴度中位数为 8.93log2 ，抗体阳性率为88.89%，详细结果见表 1，
结果表明，鸡群免疫重组禽流感病毒（H5+H7） 二价灭活疫苗后，能够诱导产生H7N9 亚型流感抗体，一免后 14d，抗体滴度达到较高水平，随后抗体滴度开始下降，二次免疫后抗体滴度持续上升，在二免后 54d 还能维持较高的抗体滴度，抗体阳性达到 88.89%，鸡群免疫疫苗后 H7N9 亚型流感抗体消长趋势见图 1。
3、讨论
（1）根据试验研究结果，采用重组禽流感（H5+H7）二价疫苗对鸡群进行免疫后，通过分析免疫抗体的滴度表明，重组禽流感（H5+H7）二价疫苗能诱导产生较高免疫抗体，表现出良好的免疫原性和免疫效果。一次免疫后在 14d达到高峰，随后抗体水平开始下降，在一免后21d 进行二次免疫比较理想，二次免疫后抗体持续上升，并维持较长时间，二次免疫后 54d，抗体阳性率达到 88.89%，表明二价疫苗的免疫程序合理有效。养殖场免疫疫苗后，要对免疫的抗体水平进行跟踪监测，并确保及时进行二次免疫。
（2）防控高致病性禽流感，疫苗免疫是较有效的措施，在防控 H5 亚型高致病性禽流感中，疫苗起到较大作用。为了应对高致病 H7N9 亚型流感，农业部及时推出（H5+H7）二价疫苗，根据试验结果，疫苗的效果比较理想，对防控H7N9 亚型流感将起到较大的作用。目前, 重组禽流感（H5+H7）二价疫苗已列入强制免疫计划的项目，但是，种禽场刚开始开展二价疫苗的免疫，种禽生产出具有高母源抗体的种卵还需要一段时间 [5] ，刚出生的雏鸡在无母源抗体或低抗体滴度的情况下，无法有效抵御野毒的侵袭，所以，种禽场要加强疫苗的免疫，做好生物安全隔离、消毒等措施。
（3）在实验室的试验结果，4log 2 的抗体滴度可以抵御强毒的攻击，但在复杂的养殖环境下，禽群应保持更高的抗体滴度才能抵御野毒的侵袭 [6] 。养殖场使用重组禽流感（H5+H7）二价疫苗可以减少免疫次数，降低成本，但是，2 种不同亚型的母源抗体水平不一致，首次免疫的日龄至关重要，所以，还需要对免疫程序进一步试验研究。
参考文献
[1] Y.M.Saif，H.J.Barnes，J.R.Glisson 等. 禽病学（第 11 版）[M]. 北京: 中国农业出版社，2005：147-166.
[2] 张进. 高致病性禽流感免疫程序的优化及应用[D].湖南:湖南农业大学，2010.
[3]黄珍霞，廖晓东.H7N9 亚型禽流感综合防控技术现状分析与对策研究[J].中国卫生事业管理,2013, （12）：949-952.
[4]贾伟新，廖明.当前我国 H5、H7 亚型禽流感流行现状及防控建议.中国家禽，2017，39（16）：1-4.
[5]宋峰,李峰,李玲，等.樱桃谷肉鸭免疫重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗血清抗体监测报告[J].中国动物保健,2017,19(11):89-92.
[6]曾显营,钟功勋,李雁冰,等.禽流感病毒 H5N1变异株灭活疫苗(Re-4 株)对鸡、鸭和鹅的免疫效果研究 [J]. 中国预防兽医学报,2010,32(10):800-803.1
作者：潘杰1，陈松春2，张险朋1* ，莫钻兰 1 ，黄育浩1（1.广东省东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086；2.广东省东莞市常平镇农业技术服务中 心 ， 广东东莞523070）
作者简介： 第一作者： 潘杰（1980-），男，广东韶关人，兽医师，从事动物防疫工作 邮箱： 751564369@qq.com
* 通讯作者：张险朋（1979-），男，广东五华人，高级兽医师，从事动 物疫病防控和兽医实验室检测工作 邮箱：xian.peng@163.com
