禽白血病病毒（Avianleukosis virus, ALV）可分为 A~J共 10 个不同的亚群，其中 A、B和 J 亚群为发生于田间的外源性病毒，是危害鸡群的主要病毒亚群 [1] 。近年陆续从中国本地鸡中分离鉴定出了一个新的 K亚群病毒，其在细胞和鸡体内复制能力较弱，常常逃逸疾病净化检测，其对生产的影响也不可小觑 [2-4] 。
近几年我国白羽肉鸡和黄羽肉鸡禽白血病净化工作取得了较大的进展，临床发病案例减少，但目前部分地方品系感染率仍较高，疾病净化工作还需要继续加强 [5] 。本研究对比了两种进口试剂盒检测 1 日龄胎粪和 ALV-J、ALV-K 感染细胞上清的灵敏性，希望为净化过程中试剂盒的选择提供方法参考和数据支持。
1、材料与方法
1.1 试验材料
10 份胎粪样品由本实验室收集保存，包含 ALV 强阳性、弱阳性和阴性样品。
ALV-J 标准毒株 NX0101由山东农业大学崔治中教授惠赠，ALV-K 毒株 GD14LZ 由本实验室分离保存，病毒滴度分别为 10 3.88 /0.1 mL、10 2.733 /0.1mL。
禽白血病抗原检测试剂盒来自两家不同公司，分别命名为 A 和 B。
1.2 试验方法
1.2.1 胎粪检测
将胎粪样品分别进行 7 个梯度（原样、1∶10、1∶20、1∶40、1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320 和1∶640）稀释后，参照试剂盒说明书进行 ELISA 检测。统计每个样品能检出阳性的最高稀释倍数。
1.2.2 细胞上清检测
待 DF-1 细胞处于对数生长期时，分别将 NX0101 和GD14LZ 毒株按照 100 、10-1 和10-2 进行倍比稀释，分别接种于 24 孔板，每孔接种 50μL，每个稀释度接种 6 孔。待细胞长满后换为 1% FBS 维持液，置于 37℃、5% CO 2 培养箱内培养。从更换维持液后第 3 天开始直到第 9 天每天收集细胞上清 350μL，冻存于 -80℃备用，并补充等量新鲜维持液 [6] 。参照试剂盒说明书进行 ELISA检测，统计各组别最早检出阳性天数。
2、结果与分析
2.1 胎粪检测结果
对于样品 2 和 3，试剂盒A 检出阳性的最高稀释倍数均是 160 倍，而试剂盒 B 可检出阳性的最高稀释倍数分别为320 倍和 640 倍（表 1）。由此可见，试剂盒 B 检测胎粪的灵敏度高于试剂盒 A。
2.2 细胞上清检测结果
ALV-J 和 ALV-K 100 稀释组，试剂盒 A 最早检出阳性时间比试剂盒 B 均提前 1 天。ALV-J 10 -1 稀释组，试剂盒 A最早检出阳性时间比试剂盒 B提前 3 天（表 2）。由此可见，试剂盒 A 检测细胞上清的灵敏度高于试剂盒 B。
3、讨论
禽白血病自首次报道以来，给世界养禽业造成了巨大的损失。目前尚无有效疫苗，只能通过不断净化种鸡群来防控该病。目前比较科学合理的净化方案是进行 1 日龄胎粪检测、6～9 周等时间进行病毒分离结合蛋清检测，不断循环淘汰 ALV 阳性鸡只。
禽白血病净化工作要求在较短时间内最大程度检出阳性个体，并降低漏检率 [7] 。相对其他检测方法如 PCR、qPCR 和IFA 斑点杂交等，ELISA 检测方法操作方法简单，更适合大批量操作，并且可快速、准确地在大规模养殖场中进行推广使用。本研究发现不同试剂盒检测不同类型的样品的灵敏度有差异，检测胎粪样品，试剂盒 B灵敏度较高，但检测细胞上清，试剂盒 A 灵敏度较高。下一步还需要增加蛋清样品检测，并进行不同批次试剂盒稳定性分析，全面评估比较两种试剂盒优劣。
对于外源性 ALV 的病毒分离，接种剂量是影响检测效果的关键因素之一。不同亚群病毒在 DF-1 细胞上的增殖速度也不同，本研究中 ALV-J 最早在接种 3 天即可检测出来，而 ALV-K 检出为阳性需要 8天以上。针对目前流行的 K 亚群病毒，进行血浆病毒分离时，将细胞维持培养 9 天可提高阳性检出率，有助于最大程度地检出阳性鸡，提高净化效率。
参考文献
[1]. Payne, L.N. and V. Nair, The long view: 40 years of avian leukosis research [J]. Avian Pathol, 2012. 41(1): p. 11-9.
[2]. 王鑫, 赵鹏，崔治中, 我国地方品种鸡分离到的一个禽白血病病毒新亚群的鉴定. 病毒学报[J], 2012(06): 609-614.
[3] Li, X., et al., Isolation, identi-fication and evolution analysis of a novel subgroup of avian leuko-sis virus isolated from a local Chinese yellow broiler in South China. Archives of Virology,2016. 161(10): p. 2717-2725.
[4] Cui, N., et al., Genomic se-quence analysis and biological characteristics of a rescued clone of avian leukosis virus strain JS11C1, isolated from indigenous chickens. Journal of General Vi-rology, 2014. 95 (Pt_11): p.2512-2522.
[5]. 范建华等, 我国部分地方鸡种禽白血病流行病学调查.安徽农业科学 , 2016 (04):133-135.
[6] 郝建勇等, 不同 ELISA 试剂盒检测 ALV-A 的效果比较. 养禽与禽病防治 , 2016 (05):36-41.
[7]崔治中,禽白血病及其防控百问百答. 中国家禽, 2017(03):72-84.
作者：刘洋1,2 ，严专强 1,2 ，廖秋生 1,3 ，黎思慧 1,3 ，王占新 1,2 ，鲁俊鹏 1,2 ，覃健萍1,2（1 广东温氏食品集团股份有限公司，广东新兴 527400 2 广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴 527400 3 广东温氏南方家禽育种有限公司，广东新兴 527400）
责任编辑：曹伟胜
