病毒样颗粒(Virus like particles，VLPs)是由病毒的一种或多种结构蛋白在异源系统内重组表达，并在该系统内或系统外自动装配成的一种不含病毒核酸的高度结构化空心颗粒 [1] 。VLPs 大小介于 15～400nm 之间 [2] ，形态上类似于真正的病毒粒子，但不含病毒核酸，无法复制和扩增，因此，不具有感染性，安全性好 [3] 。VLPs保留了天然病毒粒子的空间构象和诱导中和抗体的抗原表位，免疫原性强，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效诱导机体产生免疫保护反应 [4] 。VLPs 具有病原体相关模式分子的活性，也可激活固有免疫应答 [5] 。VLPs 疫苗作为一种新型的亚单位疫苗，具有稳定性高、免疫原性好、安全性高 [6] 及适宜大规模生产等优点。与传统疫苗相比，VLPs 具有相当的免疫原性和更好的安全性而成为一种理想的疫苗 [7] ，自从出现后就受到了人们的普遍重视，在某些程度上，传统的疫苗有可能被 VLPs 疫苗所替代。VLPs 在结构上允许外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型 VLPs 并将外源性抗原展示在其表面。此外，多数病毒 VLPs 还具有包裹核酸或其他小分子的能力，可作为基因或药物的运载工具 [8,9] ，是研制安全高效的预防病毒性疾病的潜在候选疫苗。迄今为止，国内外针对 VLPs进行了大量的研究，VLPs 技术作为最新一代的疫苗制备工艺已经得到国际认可 [10] ，并广泛应用于多种病毒病新型疫苗的研究中。本文就VLPs 在鸡病毒病预防应用方面的研究进行综述，以期为鸡病毒病的防控工作提供新的思路。
1、VLPs 的免疫机制
与其他亚单位疫苗和重组蛋白疫苗相比，VLPs 的免疫原性更强，可诱导机体产生体液免疫应答反应，主要是 VLPs 的抗原表位与天然病毒类似，并高度模仿了天然病毒的空间构象，表面有可被 Ｂ 淋巴细胞表面受体识别的成分，活化 Ｂ 淋巴细胞，上调组织相容性复合体MHCⅡ类分子水平，刺激机体产生特异性中和抗体，从而诱发免疫反应。外源的 VLPs 也能通过交叉提呈的方式，通过 MHC-Ⅰ类途径进行提呈，从而活化 CD8 + Ｔ 细胞，实现 CD8 + 细胞介导的保护性免疫反应，这对于清除细胞内的病原体如病毒等至关重要。因在递呈给树突状细胞加工、被 MHCⅡ类分子展示以及直接引起树突状细胞成熟和迁移的过程中，VLPs 的大小适合被树突状细胞(DCs)通过吞噬、渗透及 TLR 受体介导等方式高效摄取，所以具有一定的免疫佐剂分子效应，单独免疫动物就能诱导机体产生较强的免疫应答反应。VLPs 能模拟天然病毒的体内感染过程，从而激活抗原递呈细胞，尤其是进入 DCs 后，能上调 DCs 的数量并促进其成熟，使其细胞表面分子如 CD40、CD80、CD86 及 MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子表达水平明显上调，同时促进 DCs 分泌 IL-6、IL-10、MIP-1α及 TNF-α 等细胞因子，从而诱导机体产生细胞免疫应答。
2、鸡病毒病病毒样颗粒疫苗研究进展
2.1 鸡传染性法氏囊病
鸡传染性法氏囊病 (Infectious bursal dis-ease，IBD) 是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infec-tious bursal disease virus，IBDV) 引起的一种急性、高度接触传染性、杀淋巴细胞性传染病。该病不仅造成感染鸡的发病和死亡，而且可导致鸡的免疫抑制，间接引起其他致病因子的感染以及鸡对疫苗免疫的应答能力下降 [11] 。王炜等 [12]分别用 IBDV VLPs 及 VLPs+ 佐剂 PolyIC 对 14日龄非免鸡进行免疫，并用 IBDV B87 株弱毒商品疫苗作为阳性对照，同时设置空杆粒蛋白组作阴性对照及 PBS 对照。检测免疫效果，并进行动物攻毒试验。结果显示，免后第 14 天，在3 组鸡的体内均检测到高水平的抗 IBDV 中和抗体，且呈快速增长趋势。淋巴细胞增殖试验结果显示，VLPs 组、VLPs+PolyIC 组和 B87 株组鸡体内淋巴细胞增殖动态明显高于接种 PBS 和空杆粒蛋白组(P<0.01)，并且在加强免疫后明显提高(P<0.05)。攻毒后第 2 天 PBS 组和空杆粒蛋白组的鸡均表现出 IBD的典型临床症状和病理变化，且在攻毒后第 6 天全部死亡，VLPs 组鸡的存活率为 88.7%，VLPs+PolyIC 组鸡存活率为80%，B87 疫苗组鸡存活率为88.7%。
2.2 新城疫
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。对 ND 的防控，目前主要依靠疫苗接种，虽然传统的疫苗能够产生坚强的保护力，但传统疫苗主要用鸡胚生产，存在携带其他病原的安全隐患，因此，有必要研制一种新型疫苗。韩国有科研人员用不同剂量VLPs 油乳剂疫苗免疫 SPF 鸡，并进行攻毒试验，结果显示，NDV VLPs 疫苗免疫后可产生大量抗 NDV 的抗体，且 SPF 鸡对 NDV 强毒株的抵抗力与 NDV VLPs 疫苗免疫剂量相关。免疫含 20、100μg/mL NDV VLPs 疫苗能保护 SPF鸡免于强毒株感染且显著减少 NDV 排毒量 [13] 。吴芬芳等 [14] 将共表达 NDV F、HN、NP 和 M 蛋白的重组杆状病毒 rBac-F-HN-NP-M 感染 Sf9细胞，采用蔗糖密度梯度离心法纯化释放到细胞培养上清的 VLPs，免疫 60 只 18 日龄 SPF鸡，监测血清中 NDV 特异性抗体滴度的变化。2 周后用相同剂量的 VLPs 加强免疫。二免后 2周以 3.16×10 3 EID 50 的 F48E9 株强毒滴鼻攻毒。攻毒前，LaSota 灭活疫苗、LaSota+20μgVLPs 和不同剂量 VLPs 组(10μg、20μg、25μg)HI 效价分别为 28.3、28.9、24.1、26.1、26.7，攻毒后，10μg 和 20μgVLPs 免疫组仅能提供 80%和 90%的保护率，但与 LaSota 灭活疫苗、LaSo-ta+20μgVLPs 一样，25μgVLPs 试验组却能够完全抵抗致死剂量的 NDV 强毒攻击。袁乾亮等[15] 利用 Bac-to-Bac 昆虫 – 杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株 M、F、NP 和 HN 等4 个结构基因的单顺反子重组杆粒，经转染后，观察 Sf 9 细胞病变以及 PCR 鉴定结果表明成功构建了 4 种重组杆状病毒，收集重组杆状病毒采用共感染策略，Sf 9 细胞上清经超速离心，蔗糖密度梯度纯化与浓缩后，利用 Westernblotting 方法和透射电子显微镜技术检测，结果表明目的蛋白均正确表达且组装成具有完整囊膜形态的病毒粒子。
2.3 禽流感
禽流感(Avian influenza，AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV) 引起的禽类一种急性、高度接触性传染病，主要侵害禽类的呼吸系统、神经系统及消化系统等。根据 AIV 致病力不同可分为高致病性病毒、低致病性病毒和无致病性病毒 3 种。高致病性病毒可导致禽类大批死亡，低致病性病毒株能明显降低家禽的生产性能，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新毒株或毒力增强 [16] 。Pushko等[17]为构建 H9N2 VLPs 疫苗 ， 扩增了A/HongKong/1073/99 株 H9N2 血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和基质蛋白(M1)基因，利用杆状病毒 – 昆虫细胞表达系统成功表达了这 3 种蛋白，并自动装配成 VLPs，电镜观察到 VLPs 的直径约为 80～120nm，该 VLPs 具有与天然蛋白类似的免疫原性。用 10μg H9N2 VLPs 在 0 和 28天时分别皮下和肌注免疫小鼠，在 100 倍 ID 50病毒攻击下，试验组小鼠体重下降少于对照组。Haynes 等 [18] 用杆状病毒 – 昆虫细胞表达系统合成的 GagH5N1VLPs(A/Vietnam/1203/04 或 A/In-dinesia/5/05)可诱导预先感染高致病性 A/Vi-et-nam/1203/04H5N1 的小鼠及雪貂产生保护性免疫。Smith 等 [19] 将从 2013/1/Anhui/A 株 H7N9 扩增的 HA 和 NA 基因与从 2005/05/Indonesia/A株 H5N1 扩增的 M1 基因克隆到一个杆状病毒载体上，转染 Sf9 细胞后，产生由 HA、NA 和M1 组装的类似天然禽流 感病毒的 VLPs，BALB/c 小鼠动物实验结果显示，该 VLPs 疫苗引起抗同源病毒 HA 抗体滴度≥1∶64，也可交叉产生抗异源 A 型(H7N3)病毒 HA 抗体，当用致死剂量野生型的 A/Anhui/1/2013(H7N9)攻毒时，其存活率为 100%。黄晓媛等 [20] 为研究 H5N1重组禽流感病毒样颗粒(VLPs)的免疫原性，在0 周和 3 周分别以纯化 H5N1 重组禽流感病毒样颗粒、H5N1 全病毒灭活疫苗及 pH7.2 PBS 腿部肌肉注射 BALB/c 小鼠，于不同时间收集血清，以血凝抑制试验(HI)和血清 IgG 抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)评估体液免疫，CD4 + 、CD8 + T细胞亚群及酶联免疫斑点试验(ELISPOT)评估细胞免疫，并以同型毒株滴鼻攻击，观察小鼠存活率。结果病毒样颗粒各组和全病毒灭活疫苗免疫后小鼠血清 ELISA IgG 效价均有升高，中和抗体效价除病毒样颗粒 120ng/ 只免疫剂量外，其他免疫小鼠 HI 效价均达 1∶40。小鼠脾 CD4 + T 淋巴细胞亚群分类：全病毒灭活疫苗组(600μg/ 只)为 36.56%，病毒样颗粒组(120ng/只、600ng/ 只、2 500ng/ 只) 分别为 26.58%、32.20%、29.25%，PBS 组为 26.65%。CD8 + T 淋巴细胞亚群分类：全病毒灭活疫苗组(600ng/ 只)为10.78%，VLPs 组 (120ng/ 只、600ng/ 只、2 500ng/只)分别为 13.53%、14.24%和 13.35%，PBS 组为10.69%。ELISPOT 试验统计学数据显示，病毒样颗粒和全病毒灭活疫苗的小鼠脾单个核细胞分泌 IFN-γ 细胞与 PBS 组有显著性差异。小鼠保护性试验结果显示，除病毒样颗粒 120ng/只免疫剂量小鼠的存活率为 87.5%外，其他病毒样颗粒实验组小鼠均为 100%，PBS 对照组为 12.5%。杨刚强等 [21] 比较了 H9N2 的油乳剂VLPs、VLPs 和标准 H9N2 疫苗的免疫效果。取30 只 2 周龄鸡，随机分为 A、B、C 3 组，当母体抗体水平降为 0 时，对 3 组鸡进行皮下注射疫苗免疫。其中 A 组注射油乳剂 VLPs，B 组注射VLPs，C 组注射标准流感疫苗，接种量为 0.3mL/只。用 HI 检测法检测抗体效价，每周测 1 次。结果表明：自制流感 VLPs 能够提供较高的抗体水平以及为机体提供较长的保护时间，且其提供的抗体保护与标准品在统计学上存在显著差异，油乳剂 VLPs 明显优于标准品。于周璐等 [22]构建了能同时表达禽流感病毒 2 种血凝素（H5HA 和 H9 HA）以及 1 种神经氨酸酶（N1NA）的真核表达质粒。间接免疫荧光结果表明，构建的真核表达质粒转染 MDCK 细胞后，同时表达出H5HA、H9HA 和 N1NA 蛋白，转染 293T 细胞上清通过血凝试验可检测到 2～4 血凝价，通过透射电镜观察到了 VLPs。
2.4 鸡传染性支气管炎
鸡传染性支气管炎 (Avian infectious bron-chitis，IB) 是由鸡传染性支气管炎病毒 ( Avianinfectiousbronchitis virus，IBV) 引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，各种日龄和品种的鸡均易感，造成较大的经济损失。IBV 基因组容易发生变异，血清型和其抗原变异性毒株复杂，各血清型之间交叉中和作用弱或几乎无交叉反应。传统的弱毒疫苗或灭活疫苗难以应对 IBV的变异，VLPs 疫苗可以克服传统疫苗的缺陷，具有良好的发展前景。Corse 等 [23] 最早证实 IBV的 M 和 E 蛋白之间的相互作用对 VLPs 形成的重要性以及 VLPs 在 IBV 黏膜免疫中的作用，并且他们还发现 IBV 的 M、E 蛋白在 OST 7-1细胞上可以有效地组装成 VLPs。Masters [24] 报道了 IBV 的 M 蛋白参与 S 蛋白的定位及 VLPs 的形成，M 蛋白与 S 蛋白的相互作用对于 S 蛋白包装入病毒粒子非常重要，S 蛋白只有与 M 蛋白共同表达时才能够定位到位于高尔基体上的出芽位点。刘根梅等 [25] 将 IBV 的 M、S 蛋白分别或同时通过 Sf 9 昆虫细胞获得重组杆状病毒后大量感染昆虫细胞，通过超速低温离心浓缩和蔗糖梯度离心纯化后获得浓缩的 VLPs，电镜检测 VLPs 大小约 100nm，将浓缩的 VLPs 颈部皮下注射免疫 SPF 鸡，10 日龄首免，14 天后二免，结果显示 VLPs 诱导产生的免疫水平与 IBV 灭活疫苗相当。
3、总结与展望
VLPs 作为一种新型亚单位疫苗，具有多种优点，不含有病毒核酸，不具有感染性，能模拟天然的病毒粒子，易被免疫系统识别，不需要佐剂，低剂量免疫后就能刺激机体产生良好的免疫应答发应，因此，在某些程度上，有替代传统疫苗的潜力，在动物疾病的防治方面有广阔的应用前景。但在 VLPs 的研制过程中也存在一些问题，首先，VLPs 疫苗的设计、表达、组装及纯化等对技术条件要求比较高，而且不是所有病毒都能组装成 VLPs。其次，当组装多种蛋白形成的病毒样粒子时，各个基因表达量的比例难以控制，表达不同蛋白的载体进入同一细胞的几率小，产生 VLPs 的几率相对降低，建立多基因共表达载体的难度大。另外，某些蛋白可能对细胞具有毒性，使其表达量较低，甚至引起其他蛋白的表达量降低，从而导致VLPs 装配效率的下降。再次，如何有效放大工艺水平，提高 VLPs 的组装效率，降低成本等方面也存在着诸多挑战。最后，VLPs 采用不同的免疫途径，免疫效果不同，需要对不同的VLPs 的免疫途径进行研究，找出最佳的免疫途径。研制多样的 VLPs 疫苗将是一个趋势。VLPs 作为一项新兴的技术，在新型疾病疫苗的研制中代表了一种较有前途的研究方向，相信通过各国专家学者的共同努力，不久的将来VLPs 疫苗将为鸡病毒性疾病的防控提供新的技术手段。
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作者：李天芝,于新友(山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600)
基金项目：山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队项目(SDAIT-11-16)
作者简介：李天芝(1985-)，女，汉族，助理研究员，硕士，主要从事动物传染病诊断及防控技 术研究
责任编辑：曹伟胜
