鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis，IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病 [1] ，此病是严重危害养鸡业的传染病之一。2017 年 11 月至 2018 年2 月，福建漳州、江西吉安地区先后有 2 个种鸡场的产蛋鸡群出现疑似IB 症状，主要临床表现为产蛋率比正常高峰期低 4%～5%，白壳蛋、软壳蛋、沙壳蛋和畸形蛋等不合格种蛋的比例增加，无肛鸡约有 1%～2%。部分鸡只腹部较大，触诊有波动感。取死鸡或者症状较典型的病鸡进行解剖，主要表现为输卵管狭部阻塞，或形成水泡，或发育畸形等病变。
1、材料与方法
1.1 试验材料
16 日龄 SPF 鸡和 9 日龄 SPF 鸡胚由广东温氏食品集团大华农事业部 SPF 实验动物中心提供。
RaPure Viral RNA/DNA Kit、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、pMD-18 T 载体等为 TaKaRa 产品。
1.2 试验方法
1.2.1 病毒分离
用 16 日龄的 SPF 鸡与该鸡群做同居感染，并每日观察。同居 10 d后，取 SPF 鸡的气管、肝和肺等组织病料剪碎，加入双抗充分研磨，反复冻融 3 次，离心取上清接种 SPF 鸡胚，37℃培养 48h，收集胚液。将同一病料接种后收获的胚液混合，继续盲传至第三代，收获 F3 代尿囊液，直接用 1%鸡红细胞悬液检测其血凝效价。
1.2.2 鸡胚发育受阻试验
取 16 枚 10 日龄大小基本一致的 SPF 鸡胚，平均分成 2 组，即试验组和对照组。试验组通过尿囊腔接种 0.2 mL F3 代病毒的胚液，对照组接种 0.2 mL 无菌生理盐水，37℃培养 6 d，期间记录鸡胚死亡情况，6天后取出胚体观察结果。
1.2.3 病毒 RT-PCR 鉴定
按 RaPure Viral RNA/DNA Kit 试剂盒说明书提取 F3 代尿囊液病毒总 RNA，采用 Feng 等设计的引物（S1-F：5’-AAGACTGAACAAAA-GACCGACT-3’，S1-R:5’-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3’）扩增S1 全基因引物[2] 。RT-PCR 反应体系和扩增程序参照 PrimeScript OneStep RT-PCR Kit 说明书进行。扩增产物用1.5%琼脂凝胶电泳分离后，使用凝胶成像系统分析成像。
1.2.4 S1 基因的克隆测序与分析
将 RT-PCR 产物回收纯化后连接于pMD-18 T 载体，转化至 BMTOP10 感受态细胞，PCR 鉴定为阳性的菌液送至生工生物工程（上海）有限公司测序。序列使用 DNASTAR 和MEGA 7.0 软件进行拼接和分析。
2、结果与分析
2.1 病毒分离及鸡胚发育受阻试验
F3 代胚液均无血凝性，鸡胚发育受阻试验显示试验组有侏儒胚或蜷曲胚。
2.2 RT-PCR 鉴定
福建、江西样品均扩增出大小为 1 700bp 左右的片段，与预期相符，表明鸡胚尿囊液中存在IBV。将福建分离株命名为 CK/CH/FJ/ZZ01/2017，江西分离株命名为CK/CH/JX/JA01/2018。
2.3 IBV 分离株 S1 基因同源性分析
测序结果显示 CK/CH/FJ/ZZ01/2017 和 CK/CH/JX/JA01/2018 2 个分离株 S1 基因长度分别为1 672bp 和 1 680bp。对 2个分离株及 6 个常用疫苗株的 S1 基因核苷酸序列进行同源性分析，如图1 所示。结果表明分离株CK/CH/FJ/ZZ01/ 2017 与疫苗株的 S1 基因核苷酸序列同源性在 77.1%～85.5% 之 间，分离株CK/CH/JX/JA01/ 2018 与疫苗株 S1 基因核苷酸序列同源性在 77.4%～82.4%之间，2 个分离株与疫苗株的同源性较低，表明本次分离的 2 个毒株与疫苗株的亲缘关系较远。
2.4 IBV 分离株 S1 基因遗传进化分析
将 2 个分离株与 40 个参考毒株的 S1 基因构建系统进化树，如图 2 所示 。分离 株CK/CH/FJ/ZZ01/2017 属于以 QXIBV 为代表的QX 型分支，分离株CK/CH/JX/JA01/2018 属于以 TW2575/98 为代表的 TW 型分支。而目前常用疫苗株主要为 Mass 型（W93、H120、Ma5 及H52）、LDT3 型及 4/91 型，分离株与疫苗株不是同一个基因型，未处于同一分支。
3、讨论
经了解，福建发病鸡群分别于 3 日龄、10日龄、50 日龄及 150 日龄免疫了 H120 疫苗；江西发病鸡群分别于 3 日龄、50 日龄免疫了H120 疫苗，10 日龄、150 日龄免疫了 4/91 疫苗。H120 株属于 Mass 型，4/91 株属于 4/91 型，而分离株分别属于 QX 型和 TW 型，分离株与疫苗株不是同一个基因型，未处于同一分支，且同源性较低（仅在 77.1%～85.5%之间），结合临床发病情况，推断其使用的疫苗可能未起到良好的保护作用。另外，2017 年 11 月至 2018 年 2月间，正值冬季，天气寒冷，昼夜温差大，饲养人员偏重于保温工作，忽视通风管理，造成鸡舍内空气质量较差，氨气浓度过高，可能是该病发生的诱因。
在生产实际中，有必要对发病种场所在地区进行持续的 IBV 流行病学监控，确定本场或本地区的优势流行株，选择保护率高的疫苗进行免疫接种，为大生产疫病防控及新疫苗的研发提供重要的参考依据。同时，也应加强饲养管理，做好保温，加强通风，降低饲养密度，严格消毒防疫，给鸡群提供良好的环境卫生条件；做好鸡群保健，在饲料或饮水中拌入维生素、微量元素及矿物质，减少应激，增强鸡的抵抗力。
参考文献
[1] Saif Y M.苏敬良译.禽病学[M].第 11 版.北京：中国农业出版社，2005.
[2]Feng K, Wang F, Xue Y, etal. Epidemiology and characterization of avian infectious bronchitis virus strains circulating in southern China during the pe-riod from 2013-2015.Sci Rep. 2017 Jul 26;7 (1):6576. doi:10.1038/s41598-017-06987-2.
作者：陈顺艳1，蓝赐华1，王安全1，陈金地1，严专强1，覃健萍1，陈峰12*（1 广东温氏食品集团股份有限公司，广东新兴 527400；2 华南农业大学，广州510642；）
* 通讯作者：陈峰，男，推广研究员，硕士生导师。
责任编辑：曹伟胜
