血凝抑制试验是检测禽流感和新城疫抗体水平的主要方法，在基层动物疫病防控中心实验室中有着广泛的应用。但是，该方法受较多因素的影响，结果常有较大偏差，其中 4 单位抗原的配置是困扰基层实验室工作者的最大问题。本实验将新城疫试验抗原按不同倍数稀释后，测得其平均效价，配置而得的 4 单位抗原较准确；并且本文介绍了多重校对法，可以直接推算出微调抗原的方法，为 4 单位抗原的配置和校对节省了较多时间，对基层实验室工作者有较大的帮助。
1、材料
1.1 试剂
鸡新城疫病毒血凝抑制试验抗原（中国兽医药品监察所，批号： 201611）、1%鸡红细胞悬液、PBS溶液（0.1 mol/L，pH 值 7.2）。
1.2 仪器设备及耗材
微量振荡器（江苏省金坛市医疗器械厂）、96孔 V 型反应板、8 道或 12 道移液器（10～100μL）、移液器滴头（美国 Axygen）、加样槽等。
2、方法
2.1 抗原的效价测定
2.1.1 原倍法直接测量抗原的效价
将 25μL 新城疫抗原依次倍比稀释，测定原倍抗原的血凝效价，具体见血凝试验[1]。
2.1.2 稀释法测抗原的平均效价
将新城疫抗原按照原倍(1)、1/3、1/5、1/7 倍进行稀释，分别测量抗原效价，具体见血凝试验[1]。按照公式测定抗原效价的平均值，从而准确地测量抗原的效价。
2.2 4 单位抗原的配置
分别按原倍法和稀释法测的抗原配置 4 单位抗原，抗原的效价值除以 4 即为稀释倍数[2]。
2.3 4 单位抗原的校对
2.3.1 直接校对法
将 25 μL 的 4 单位抗原用 PBS 等量倍比稀释，使每孔含有 2 HAU、1 HAU、0.5 HAU、0.25 HAU（见图1，1~5 孔），每孔补加 25μL PBS，再加入 1%红细胞悬液[2]。
2.3.2 多重校对法
在直接校对法的基础上，增加 6~10 孔的操作。即 6 孔中加入 50 μL PBS，将 25 μL 的四单位抗原用 PBS 等量倍比稀释（6 孔弃去 25 μL PBS，保证体系一样），使每孔含有 4/3 HAU、2/3 HAU、1/3 HAU、1/6 HAU（见图 1，1~10 孔），每孔补加 25 μL PBS，再加入 1%红细胞悬液[2]。
3、结果
3.1 抗原效价的测定
原倍法直接测量新城疫抗原的效价为 8（如表 1）。
稀释法分别测原倍、1/3、 1/5、1/7 倍的效价为：28、26、25、 24，可以按照表 1 计算抗原的平均效价为 27.49，则该抗原的平均效价为 180。
3.2 4 单位抗原的配置及校对
根据原倍法测得的抗原效价，抗原做 64（256/4）倍稀释即可得到四单位抗原；而稀释法将抗原 45（180/4）倍稀释。然后对 2 种方法配置的 4 单位抗原进行校对，结果原倍法配置的 4 单位抗原偏小，出现 1、6 孔完全凝集，其他孔有不同程度的拉线；而稀释法配置的抗原如图 1 所示，较标准。
3.3 4 单位抗原的微调
由于原倍法配置的 4 单位抗原偏小，需进行微调，经推算需再加入 1/3 的抗原。再次用多重法进行校对，则出现图 1 的结果，说明微调后的 4 单位抗原较准确。
4、讨论及结论
4 单位抗原是血凝抑制试验的重要环节，其准确性对试验结果有重要的影响。抗原浓度高时，HI 抗体效价就会降低；反之则会有所升高。抗原效价测量是否准确，决定了配置而得的 4 单位抗原准确性。稀释法测定而得的抗原效价通过稀释多次测量获得抗原的平均值，其结果更加接近准确值。
4 单位抗原需现配现用，且用之前要进行校对，保证其准确性[3]。按照直接法校对的 4 单位抗原只能判定配置结果是否准确，针对校对结果不准确， 并没有好的方法，许多文献[4,5] 均说明要进行微调后进行校准，但是均未说明如何微调。而多重校对法，能够准确地计算出需加入的抗原（PBS）的量， 保证了微调后的 4 单位抗原的准确性。最多 2 次校对即可准 确地配置好 4 单位抗原，避免了反复校对，影响血凝抑制试验的进度，具有较大的参考意义。
参考文献
[1] GBT 16550-2008 新城疫诊断技术[S].
[2] SNT 1182-2010 禽流感检疫技术规范[S].
[3] 顾小明. 家禽血凝试验及血凝抑制试验的操作方法及注意事项 [J]. 中国畜牧兽医文摘. 2016，32(8):50.
[4] 常磊,孙娅莉,吴德喜,等.血凝和血凝抑制试验的影响因素 [J]. 中国家禽 .2011，33 (16): 57-58.
[5] 丰春燕. 影响禽流感血凝和血凝抑制试验的因素分析 [J] . 中国畜牧兽医文摘. 2016，32 (12):55.
作者：任义品1、韩渝濠2（ 1.河南省漯河市动物疫病预防控制中心河南漯河 ，462000; 2.普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳 471000 .）
责任编辑：徐成刚
