广东地区小鹅瘟病毒分离鉴定及全基因序列的测定分析

鹅细小病毒病又称小鹅瘟，是由鹅细小病毒( Goose parvovirus，GPV)引起的雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性传染病，造成肠栓塞、纤维素性肠炎及神经症状等，具有高发病率和死亡率 ^[1] ,严重制约着水禽业的发展。

GPV 基因组为单链线性 DNA，5 106 bp。其基因组由左右两个开放阅读框（Open ReadingFrame，ORF）和两端的末端重复序列（Invertedterminal repeats, ITR）组成 ^[2] 。分析 GenBank 上各水禽细小病毒基因组序列发现，在两个 ORF 之间间隔 18bp，左侧 ORF 编码 NS1 和 NS2 两个非结构蛋白。右侧编码区编码结构蛋白，GPV共编码 3 个结构蛋白（VP1、VP2 和 VP3），VP2和 VP3 是病毒的主要衣壳蛋白，GPV 主要抗原决定簇分布在其中 ^[3] 。

本实验室近几年一直在对鹅细小病毒进行流行监控，2016 年广东地区一鹅场 7 日龄的雏鹅发病死亡率高达 70%，剖检发现雏鹅的肠道有栓塞现象，胰腺有白点，肝脏肿大等疑似小鹅瘟的症状。实验室采集发病雏鹅的肠、肝脏、胰腺等进行了病毒的分离鉴定，确诊为小鹅瘟，并对分离株进行了全基因序列的测定分析，以了解广东地区流行 GPV 的基因特征，又为疫苗株的选用及疾病的防治提供可靠的依据。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

广东地区某鹅场。

1.1.2 鸭胚

购自广东地区某孵化场。

1.1.3 实验动物

购自佛山某鸭场（母源抗体较低）。

1.1.4 质粒、菌株

克隆载体 pMD18-T、Top10 感受态细胞为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.1.5 试剂及耗材

胰蛋白胨、酵母提取物为 OXOID 公司产品；0.22 μm 无菌滤器为 Millipore 公司产品；琼脂糖为北京百奥康生物技术有限公司产品；Gold view I 型核酸染色剂、DNA marker DL2000、DL5000，Premix TaqTM （EX TaqTM Version 2.0plus dye）、LA Taq 聚合酶 、Premix Ex Taq TM（Probe qPCR）试剂盒均为 Takara 公司产品；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 为爱思进生物技术（杭州）有限公司产品，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 细胞培养液为 GIBCO 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料的处理及病毒在鹅胚上复制

将采取疑似发病鹅的肝脏、小肠等组织器官研磨，加入适量的双抗溶液，反复冻融 3 次，6 000 r/min 离心 10 min，4℃静置 4 h，然后通过尿囊腔接种法接种 12 日龄鸭胚，每胚 0.2 mL，置于 37℃孵化箱孵化，每天照胚，弃去 48 h 内死亡的胚。收集 48 h 后死亡的鸭胚尿囊液，同时观察胚体变化，并用此尿囊液在 12 日龄番鸭胚上盲传 3 代。收集尿囊液，于 -80℃保存。

1.2.2 病毒在 GEF 细胞上的复制

首先参照 2010 年版兽药典制备鸡胚成纤维细胞 SOP 标准进行 GEF 细胞的制备，使每毫升约含 1×10⁶ 个细胞，将细胞铺到 6 孔板中，每孔 2 mL，24h 生长至单层后，接种上述尿囊液，在 37℃、5% CO₂ 培养箱中孵育 1h 后，用 PBS洗 3 遍，加入含 2%FBS DMEM 培养基，置于37℃、5%CO₂ 培养箱中培养 96 h，每天观察细胞病变，在出现 80%细胞病变或 96 h 后，收集细胞及上清，于 -80℃保存。

1.2.3 小鹅瘟特异性 PCR 检测

小鹅瘟特异性检测引物参照孟繁兴 ^[4] ，引物序列为 GPVF：F：5，-CCAAGCTACAACAACCA-CATCTAC-3，R：5，-CTGCGGCAGGGCATAGA-CATCCGAC-3，将收取的尿囊液和细胞液按照AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量提取试剂盒说明书进行操作，参照 Premix TaqTM（LATaqTM Version2.0 plus dye）试剂盒说明书进行PCR 扩增。体系为 Primer Taq：10 滋L，上游引物：1 滋L，下游引物：0.1 滋L，ddH 2 0:6 滋L,模板：2 滋L。PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增：94℃预变性 4 min；94℃变性 30s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 40 s / 40s，共进行 30 个循环；72℃终延伸 10 min。

1.2.４ 病毒动物回归

将上述收集到的致死鹅胚的尿囊液，取0.2 mL 10 ^4.0 EID ₅₀ /0.2 mL 的病毒经肌肉注射 7 日龄无母源抗体的番鸭。攻毒后逐日观察并记录小鸭的精神状态、饮食、饮水情况，发病和病死情况。

1.2.５ 细小病毒总 DNA 的提取

按照 AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量提取试剂盒说明书进行操作。

1.2.６ 全基因引物的设计与合成

引物设计参照在 GenBank 上载的 GPV B株、GPV 06-0329 株和 MDPV GX5 株序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如表 1 所示。

1.2.7 PCR 扩增

参照 Premix TaqTM （LA TaqTM Version2.0plus dye）试剂盒说明书进行 PCR 扩增。体系为PrimerTaq：20 滋L，上游引物：2 滋L，下游引物：2 滋L，ddH 2 0:12 滋L, 模板：4 滋L。PCR 扩增仪中按照以下程序进行扩增：94℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 40 s /2min，共进行 32 个循环；72℃终延伸 10 min。扩增 ITR 区和中间编码区过程中，72℃延伸的时间分别定为 40 s 和 2 min。用 1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的条带。

1.2.8 PCR 扩增产物的回收和纯化

使用 Axygen 凝胶回收试剂盒进行 PCR 产物的回收与纯化，按说明书操作进行。

1.2.9 PCR 纯化产物与载体连接

连接反应参照 TaKaRa 公司 pMD18-TVector 使用说明进行 。连接反应体系为pMD18-T Vector：1 滋L，Solution I：5 滋L，PCR 产物：4 滋L，混匀离心后，于 16℃连接过夜。连接产物直接用于下一步转化实验。

1.2.10 连接产物转化感受态细胞

将感受态细胞从 -80℃中取出，融化后取50 滋L，加入上述的连接产物 5 滋L，轻轻混匀，冰上放置 30 min；于 42℃热休克 90 s 后迅速冰浴 10 min；加入 200 滋L LB 液体培养基，于 37℃摇床中以160 r/min 振摇培养 60 min；将慢摇后菌液均匀涂布于已预热的 LA 固体培养基中，待菌液被平板吸收后，将平板放在 37 ℃温箱中倒置培养 12~16 h。

1.2.11 阳性菌落的筛选和鉴定

从上述平板中挑取 5~10 个单克隆菌落，分开接种于 1 mL 含 LA 液体培养基中，37℃，220 r/min 振摇培养 4 h。直接用上述菌液作为PCR 模板进行菌液 PCR 鉴定，鉴定阳性的，每个基因片段选择 3 个经 PCR 检测为阳性的菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.12 序列拼接与分析

测序结果用 DNAStar 分析软件中的 Seq-Man 进行拼接、整理，利用 MegAlign 进行列的比对分析，利用 MEGA 7.0 进行进化树的构建。

2、结果与分析

2.1 病毒分离

2.1.1 病毒在鹅胚上的分离

可引起第一代培养物在第六天左右出现死亡，取出胚体，可见胚体颈部四肢皮肤均有充血出血，肝脏轻度出血（见图 1）。

2.1.2 病毒在 GEF 上的分离

尿囊液接种 GEF 细胞，盲传 3 代，在第 4天左右细胞出现变圆，皱缩，折光度增强，最后细胞脱落细胞间隙增大（图 2）。

2.1.3 PCR 鉴定

PCR 扩增病毒基因，得到的条带与预期条带大小 375 bp 相似。

2.1.4 动物回归试验结果

第二天开始发病，第三天出现死亡；前期发病严重，第二周后症状开始减轻，到第三周病鸭基本恢复正常；病鸭出现断毛、精神沉郁、脚软喜卧；病死鸭剖检发现肝脏肿大出血，胰腺发白出血，十二指肠糜烂，卵黄蒂附近肠段严重肠栓塞，肠出血（见图 3）。

2.2 分离株全基因序列的测定分析

应用序列分析软件 DNAStarLasergene 7.1中的 SeqMan 对测序结果进行拼接，各毒株基因组片段具体信息如表 2 所示。

2.2.1 全基因序列同源性分析

ZJF 分离株序列全长为 5 046 bp，与江淮地区报道的鹅源 LH 株的基因全长相同，同源性也最高为 98.6%，与欧洲标准 B 株全基因同源性为 98.5%，相比在末端重复序列有碱基的缺失。与 GPV 疫苗株 GDaGPV、SYG61v 同源性较低，为 93.8%、93.9%。与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株同源性为 94.9%、95%。与番鸭细小病毒病代表株 MDPV-P1 株及 SAAS-SHNH 株同源性最低，为 81.4%，86.1%。

2.2.2 ITR 区序列分析

ZJF 分离株与 Genebank 已经发表的 11 株小鹅瘟的 ITR 序列进行比对分析，ITR 结构的同源性在 92.3%～99.3%之间，与江淮地区的LH 株、SHFX1201 株同源性最高，为 99.3%，基因片段长度一致。与欧洲标准 B 株同源性为98.1%，与其相比在 ITR 区 67～80bp（CACGT-GTTTCCGGT）及 333～347 bp（AGCATGTGAC-CGGA）处有碱基缺失。与 GDaGPV、SYG61v 株同源性为 93.0%、92.3%，也存在 67～80 bp（CACGTGTTTCCGGT）及 333～347bp（AGCAT-GTGACCGGA）处缺失。进化树显示 ZJF 株与RC16 重庆分离株、江淮地区 LH 分离株等处于同一小分支，与 GDaGPV、SYG61v 株（GPV 弱毒苗致弱前毒株）进化关系稍远，处于不同的小分支中，进化树见图 4。

2.2.3 NS 基因序列分析

ZJF分离株 NS 基因全长为 1 884 bp，编码627 个氨基酸，与 Genebank 上已发表的 11 株GPV 的非结构蛋白 NS 相比，其核苷酸同源性在 93.5%～99.2%，氨基酸同源性在 96.7%～99%。其中 ZJF 株与江淮地区分离株 LH、SHFX1201 株、YZ 株氨基酸同源性最高，为99%，与欧洲标准株氨基酸同源性为 98.9%，与GDaGPV 株、SYG61v 株氨基酸同源性稍低，为97%、97.6%，与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603株核苷酸同源性分别为 95.9%、95.7%。进化树显示 ZJF 株处于经典 GPV 分支，与江淮地区分离株 LH、SHFX1201 等处于同一小分支，与GDaGPV、SYG61v 株（GPV 弱毒苗致弱前毒株）进化关系稍远，处于不同的小分支中，进化树分析见图 5。

2.2.4 VP1 基因

ZJF分离株的结构基因 VP1 全长为2 199bp，无任何核苷酸的缺失或插入，编码 732个氨基酸，与 Genebank 上已发表的 12 株 GPV分离株相比，核苷酸同源性为 94.5%～99.7%，氨基酸同源性为 97.3%～99.3%。与江淮地区Yan-1 株核苷酸、氨基酸同源性最高，为 99.7%（99.3%）。与江淮地区 LH、SHFX1201 株等分离株核苷酸、氨基酸同源性在 97.3%～97.9%（98.2%～99.3%）。与欧洲标准株 Virulent B 株核苷酸、氨基酸同源性为 97.5%（98%）。与GDaGPV、SYG61v 株核苷酸、氨基酸同源性较低，分别为 94.5%、94.7%（97.4%、97.8%）。与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株核苷酸、氨基酸同源性分别为 95.2%、95.3%（97.3%、97.4%）。分析显示，ZJF 分离株属于 GPV 分支，在这个大分支中又分为不同的小分支，ZJF 分离株与安徽Yan1 分离株属于同一小分支，江淮地区以 LH、SHFX1201 株为代表的分离株处于一个小分支，欧洲标准株 Virulent B 株处于一个小分支，GDaGPV、SYG61v 株处于一个小分支中，番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株处于同一小分支中，提示小鹅瘟的 VP1 基因存在抗原的多样性，VP1 进化树见图 6。

3、讨论

对华南地区一鹅场送检的病料进行常规处理后，通过鹅胚、鹅胚成纤维细胞进行病毒分离、PCR 方法进行病毒鉴定结果分离到一株小鹅瘟毒株，命名为 ZJF 株。经过全基因序列的测定分析，ZJF 分离株序列全长为 5 046 bp，与江淮地区报道的 LH、SHFX1201 等基因全长基本相同，同源性也最高，为 98.2%～98.6%，与广东地区早期 GDaGPV 分离株同源性较低，为93.8%，与番鸭小鹅瘟 SDHZ1604、JS1603 株同

源性为 94.9%、95%，与番鸭细小病毒病代表株MDPV-P1 株及 SAAS-SHNH 株同源性最低，为81.4%、86.1%。ZJF ITR 分离株区全长与江淮地区 LH 株、SHFX1201 株相同，为 414bp，相较于欧洲标准株 Virulent B 株、GDaGPV 有碱基的缺失，有报道称 ITR 的长短与病毒的毒力有关，短的毒力为强毒株，长的为弱毒株，与本研究 ZJF分离株为强毒株相符合 ^[5] 。

ZJF 分离株 ITR 结构、NS 基因、VP1 基因进化树显示多样性，ITR 结构、NS 基因进化树分析表明 ZJF 株与重庆分离株 RC-16、江淮地区分离株 LH、SHFX1201 株等处于同一小分支中，进化关系较近。VP1 基因进化树表明，ZJF株与安徽 2011 年的 Yan-1 分离株处于同一小分支中，进化关系最近，与 LH 等株进化关系相对稍远。ZJF 分离株与广东 1978 年分离的GDaGPV 的进化关系相对较远，有可能是由于广东地区小鹅瘟毒株一直在持续地进化，也有可能与本地雏鹅苗不足，大量外购外地鹅苗，导致新的小鹅瘟毒株的引入。

国内对于水禽 GPV 全基因测序研究相对较少，导致 GPV 病毒基因分型较混乱，所以对GPV 病毒进行全基因序列的测定分析是十分有必要的。

参考文献

[1]Schettler C H. Isolation of a highly pathogenic virus from geese with hepatitis [J]. Avian Diseases,1971,15（2）:323-325.

[2] 贺亦龙. 5 株水禽细小病毒基因组的克隆与遗传进化分析[D]. 东北农业大学, 2014.

[3] Tatar-Kis T, Mato T, Markos B, et al.Phyloge-netic analysis of Hungarian goose parvovirus iso-lates and vaccine strains [J]. Avian Pathology,2004,33（4）:438-444.

[4]孟繁兴，董浩，胡振林，等. 鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析[J].中国兽医杂志，2015，12（51）：33-35.

[5] 吕亚楠等.小鹅瘟病毒 PCR 检测方法的建立及江淮地区小鹅瘟病毒分子流行病学调查[D].扬州大学, 2014.

作者：刘佳佳^1,2 ，苏晓娜¹，王占新^1,2，覃健萍^1,2，曾凡桂^1,2，严专强^1,2，鲁俊鹏 1,2*（1.广东温氏食品集团股份有限公司，广东新兴 527439；2.广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴 527439；）

责任编辑：曹伟胜